После окончания школы Валерий Золотухин покинул родное село и отправился в Москву поступать на отделение музыкальной комедии в ГИТИС. В 1963 году он закончил университет и был приглашен в Театр имени Моссовета, а через год перешел в Театр на Таганке.
Дебют В. С. Золотухина в кино состоялся в 1965 году в фильме «Пакет», где он сыграл главную роль Пети Трофимова. Но популярность пришла к Золотухину несколько позже вместе с его ролью в фильме «Хозяин тайги». В этой картине актер сыграл роль молодого неопытного участкового Василия Снежкина в паре с Владимиром Высоцким, своим лучшим другом. После этого фильма В. С. Золотухина знала вся страна.
В 1971 году свет увидела музыкальная комедия «Бумбараш» с Валерием Золотухиным в главной роли, что принесло ему огромную популярность. Песни его героя Юлия Кима стала напевать вся страна. После выхода этой картины и начался расцвет творчестве В. С. Золотухина: в 70-е он снялся в фильмах «Пропажа свидетеля», «Берега», «Каждый день доктора Калинниковой», «Царевич Проша» и др. В 80-е и 90-е актер все больше посвящает себя театру, и значительных ролей в кино у него не было. В 2000-е годы его можно увидеть в таких фильмах, как «Ночной дозор», «Дневной дозор», «Участок», «Мастер и Маргарита», «Черная молния» и пр. На протяжении своего творческого пути Валерий Золотухин снялся в 80 фильмах, является автором многих публицистических и художественных книг.
С 2003 года Золотухин работал художественным руководителем Молодежного Театра Алтая (МТА), где при его участии был осуществлен ряд крупных театральных проектов. В память об актере театр сейчас назван его именем.
В 2013 году актер скончался, и был похоронен в своем родном селе возле церкви Покрова Пресвятой Богородицы.
Мемориальный музей Золотухина открылся в Быстром Истоке в 2016 году. Это один из самых современных интерактивных музеев Алтайского края. Также действует экспозиция в доме его родителей.
Детский театральный фестиваль "Исток" им. В.С. Золотухина ежегодно проходит осенью на малой родине артиста под руководством его жены актрисы Ирины Линдт.